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荧光定量PCR的原理

时间:2014-01-22 18:04:27    
  荧光定量PCR(Fluorogenic Quantitative PCR,简称FQ-PCR)技术融汇PCR和DNA探针杂交技术的优点,直接探测PCR过程中荧光信号的变化,根据PCR反应酶动力学特点,获得DNA模块的准确定量结果。该技术整个实验过程均在完全闭管的状态下进行,无需PCR后处理和冗长的电泳检测,解决了常规PCR实验不能定量分析及扩增产物污染而导致的假阳性,操作繁复等问题,成为常规PCR的更新换代技术,是目前最先进的PCR技术。
生物学基础
按PCR方式进行的体外基因扩增。
酶学基础
Taq酶的 5'→3' 外切核酸酶活性,可以在链延伸过程中实现链替换,并将被替换的单链切断。
荧光化学基础
反应体系中,不仅有两条普通的引物,还有一条荧光标记探针。这条探针的5'端和3'端分别标记了荧光报告基因(R)和荧光淬灭基团(Q),当这条探针保持完整时,一旦探针被切断,淬灭作用消失,R基团的荧光信号就可以被测定。连续检测荧光的强度与待测的DNA浓度呈正比。
FQ-PCR 反应的实现
荧光标记探针结合在PCR扩增区的中间。PCR反应开始后,随着链的延伸,Taq酶将荧光探针切断,释放出R基团的荧光信号。被释放的游离R基团的荧光信号强弱与PCR产物数量成正比关系,测量出前者就可以算出后者。
FQ-PCR 技术指标
定量范围:0~1010/ml样品
定量准确度:±100%
荧光5'核酸酶化学